ماهی تنها

برای بررسی کروموزم ها از نظر ظاهری و شناخت بیشتر ساختارهای مختلف آن از نظر عملکردی در چندین مقطع از چرخه سلولی می توان آن ها را مطالعه نمود . بررسی در هر مرحله دارای معایب و محاسنی می باشد. کشف تکنیک های بندینگ گامی مهم در شناخت بیشتر کروموزوم ها و بررسی مرفولوژیک آنها بود. بعضی از محققین تحولات سیتوژنتیک انسانی را در روند شناخت بیشتر کروموزوم ها به 5 دوره ( eras ) تقسیم نموده اند:

Dark ages

Hypotonic period

Trisomy period

Banding era

And molecular era

دوره بندینگ

پیشرفت بیشتر در تکنولوژی منجر به دست یابی به تکنیک های بندینگ گردید. پیشرفت بیشتر در تکنولوژی منجر به دست یابی به تکنیک های بندینگ گردید. تا قبل از این روش ها، یا تا قبل از 1970 از روش رنگ آمیزی توپر استفاده می کردند. این روش ها باعث گردید تا بندهای افقی با رنگ تفرقی ( اولین بار به کمک میکروسکوپ های فلوئورسنس ) در طول کروموزوم مشاهده گردد. الگوی بندها برای هر کروموزوم اختصاصی بود و اجازه می داد که هر کروموزوم به صورت فردی شناسایی شود و این کمک می نمود تا اختلالات ساختمانی همراه با سندرور های ژنتیکی تشخیص داده شوند. امروزه در کنار این تکنیک ها از روش های High resolution برای افزایش دادن تعداد بندها و مشاهده بندهای کوچکتر استفاده می شود. با استفاده از الگوها ی بندینگ هم کروموزوم ها از هم قابل تشخیص شدند و هم الگوهای اختصاصی نوار بندی برای هر گونه رقم خورد و در واقع قابل دست یابی بودن مجدد بندها و بکارگیری این الگوها گام های مهمی در جهت پی بردن به ساختمان ظریف و دقیق کروموزوم ها بود.

اما از سال 1970 با این تصور که کروموزوم دارای ساختمان شیمیایی یکنواخت و همگن نیست ، پیشنهاد بکارگیری مواد مختلف با توجه به تاثیرات متفاوت آنها بر ساختمان کروموزوم و قسمت های مختلف تشکیل دهنده آن مطرح گردید.

Caspersson و همکاران ( 1970-72 ) برای اولین بار نشان دادند که هر کروموزوم متافازی دارای الگوی نواری بندی خاصی است که در سلول بدون تغییر می ماند و می توان آن را شاخصی برای شناسایی آن کروموزوم بکار برد.

از عوامل موثر بر شکل گیری بندها و تنوع الگوهای بندینگ می توان به موارد زیر اشاره نمود :

1- تفاوت های ساختاری در طول کروموزوم که مرتبط با ترکیب جفت بازها می باشد.

2- وجود بخش های تکراری

3- مدت زمان لازم برای همانند سازی

4- شکل گیری و سازمان یابی کروماتین

چگونگی منطقه بندی کروموزوم در بندینگ:

برای نشان دادن بندها که اصول آن در اولین کنفرانس پاریس در سال 1971 بنا گذاشته شد. برای یک منطقه معین روی کروموزوم چهار ویژگی در نظر گرفته می شود.

1- شماره کروموزوم مثلا 2 و 15 و 21

2- سمبل بازو p یا q : بازوی کوتاه با p گرفته شده از petit و بازوی بلند با q گرفته شده از queue نشان داده می شود ( یا p+q=1 ) .

3- Regions یا نواحی

نواحی توسط landmark های بخصوص مشخص می شوند که از نظر مرفولوژیکی دارای محدوده مجزا و مشخص می باشند، از قبیل انتهای کروموزوم ها، سانترومر و بندهای معین و خیلی واضح . شماره نواحی روی بازوی های کروموزوم با توجه به تقسیم بندی نواحی تحت عنوان  و  و ... و بازوی بلند به صورت  و  و .......... مشخص می شود.

4- Bands : نواحی به بندها با نامگذاری مانند  و  و . تقسیم می شوند شماره گذاری بندها از سمت سانترومر به سمت تلومر صورت می گیرد و نواحی اطراف سانترومر با شماره 1 مشخص می شوند در شماره گذاری عدد اول شماره ناحیه، عدد دوم شماره بند، اعداد بعد از نقطه 14.22. نشاندهنده بندهای resolved شده بعد از نامگذاری سال 1971 می باشند مانند: ( one – one – not eleven ) :   اما با پیشرفت روش های آزمایشگاهی تقسیم بندی بندهای مناطق کروموزومی از دقت بیشتری برخوردار گردید ( شکل 2 ):

بند کروموزومی:

بند قطعه ای از طول کروموزوم است که با استفاده از تکنیک های رنگ آمیزی و آماده سازی قبل از رنگ آمیزی از قطعات مجاور با ظاهر تیره تر یا روشن تر قابل تشخیص می باشد. ظهور و سایز بندها بسته به تنوع ساختمانی یا تکنیکی دارد ( Harnden and Klinger 1985 ).

به عبارت دیگر بند قسمتی از کروموزوم است که بعلت روشن تر یا تیره تر بودن نسبت به قسمت های مجاورش قابل تشخیص است . در طول کروموزوم هایی که الگوهای بندینگ یا نوار بندی را نشان می دهند بندها شماره گذاری می شوند. جهت شماره گذاری از سمت سانترومر به طرف تلومر ها می باشد به طوریکه نواحی اطراف سانترومر با شماره 1 مشخص می شوند.

تعداد نوارها یا بندها

تعداد نوارها یا بندها بستگی به طول و بلندای آن و یا فشردگی و کوتاهی کروموزوم دارد و به عبارت دیگر تعداد این ها شدیدا وابسته به متراکم بودن یا تراکم کم کروموزوم دارد. تعداد بندها بطور روتین در کروموزوم های متافازی انسان دارای میانگین برابر 450 – 400 بند در ست هاپلوئید (Haploid set ) می باشد. که این تعداد در متد high – resolution شدیدا افزایش یافته و به حدود 850 – 550 می رسد. اگر چه گزارش هایی مبنی بر تعداد بیشتری یعنی تا حدود 1250 بند نیز منتشر شده است. تعداد بندها را با شمردن بندها در یکی از جفت کروموزوم های همولوگ متافازی برآورد می کنند. البته باید به این نکته توجه داشت که تنوع بندهای کروموزومی برای کار روتین آزمایشگاه ها جالب نیست.

از جمله روش های شمارش بندها این است که تعداد بندها در طول یک کروموزوم شاخص در نظر گرفته می شود ( مثلا کروموزوم 10 ) و این تعداد برای کل کاریوتیپ تعمیم داده شود ( Stallard and Johnson 1983 ) یا پیشنهاد هائی مثل استفاده از کروموزوم های رفرنس و نواحی کروموزومی و کروموزوم X برای برآورد نمودن کل بندها ( Josifek 1991 ) ارائه می گردد.

به هر حال با توجه به الگوی نامگذاری بین المللی موقعی که یک منطقه معین را روی کروموزوم نشان می دهیم چهار ویژگی باید در نظر گرفته شود.

1- شماره کروموزوم

2- سمبول بازوی کروموزوم

3- شماره ناحیه

4- شماره بند در درون ناحیه

کروموزوم بندینگ:

تکنیک های آماده سازی برای متدهای بندینگ ایجاد تغییراتی در هر دو وضعیت ساختمانی و بیوشیمیایی کروموزوم می کنند . در این رابطه لازم است به نکات زیر توجه نمود:

- کروموزوم های فیکس شده معادل کروموزوم های in vivo نیستند.

- عمل فیکس کردن به نظر نمی رسد که DNA را از کروموزوم ها خارج کند اما احتمالا بعضی از پروتئین ها مثل هیستون ها و غیر هیستون ها را در مقادیر متفاوت ( تحت اثر اسید استیک ) خارج می کند . فیکساتیو ممکن است همیشه یک اثر کمی و قابل تکراری روی این پروتئین ها نداشته باشد.

- رنگ گیمسا برای هتروکروماتین ساختاری مجاور سانترومرها و تلومرها اختصاصی می باشد.

کاربرد های بندینگ کروموزومی:

- سازمان دادن نقشه های فیزیکی کروموزوم ها

- آنالیز کروموزومی ( ساختمان و اختلالات )

- شناسایی کروموزوم ها بصورت انفرادی یا شناسایی کروموزوم ها از یک گونه در یک هیبرید.

تکنیک های نوار بندی:

این تکنیک ها به دو گروه تقسیم می شوند:

1- تکنیک هایی که با توجه به کارهایی که روی کروموزوم در مراحل نواربندی اعمال می گردد سبب تشکیل نوارهائی با الگوی مشخصی در طول کروموزوم می شود. مثل G بندینگ.

2- تکنیک هایی که به صورت اختصاصی بخش خاصی از کروموزوم را رنگ می کنند.

بخش های قابل توجهی از DNA دارای رنگ پذیری اختصاصی می باشد مثل NOR و سانترومر .

گیمسا بندینگ

در متد G-banding یا گیمسا بندینگ معمولا از محلول رقیق تریپسین به صورت ( Pretreatment )، اوره ( urea ) و یا پروتئاز استفاده می شود. اولین گزارش در مورد نوار بندی G در کروموزوم های انسانی در سال 1971 ( Samner et al 1971 ) منتشر شد. این الگو همراه با دیگر الگوهای Q ، R توسط سیتوژنتیسین ها برای شناسایی کروموزوم ها و تنوع در ساختمان آنها بکار می روند ( شکل های 3 و 4 ). در این الگو دقیقا دوکروماتید خواهری یک کروموزوم بویژه در درون یک گونه همانند هستند.

الگوی نوار بندی G قابل دست یابی مجدد از یک فرد به فرد دیگر و همچنین از یک نوع سلول به دیگری می باشد. این شباهت با توجه به این مسئله است که متراکم شدن کروموزوم های متافازی بطور قابل ملاحظه ای از یک گستره سلولی به گستره دیگر روی همان اسلاید متنوع می باشد. در همین الگوها کروموزوم های بلندتر تمایل دارند تا بندهای بیشتری را نشان دهند ( شکل 2 ) . به این دلیل این که بندهای بزرگتر هر کدام می تواند بندهای کوچکتر و بیشتری را نشان دهد. اگر چه این بندها در ادامه روش کاری که در آزمایشگاه و به صورت in vitro  صورت می گیرد مشاهده می گردند ولی می توانند منعکس کننده ویژگی ساختمانی کروموزوم متافازی باشند.

در هر بند حدود وجود دارد. احتمالا تفرق نقاط تیره و روشن به توزیع پروتئین و DNA کروموزومی بر می گردد.

همه ژن های ( house keeping genes ) و 40 % ژنهای Tissue- specific همراه با نواحی غنی از GC هستند که بعنوان جزایر CPG شناخته شده اند و در حدود 86 % جزایر CPG در R بندها مشاهده گردیده اند.

این روش نسبت به C-band ها جزئیات بیشتری را روشن می کند و همراه با متدهای C و RQ بندینگ توسط سیتوژنتیسین ها برای شناسایی کروموزوم ها و تنوع در ساختمان آنها در مقایسه با نوع استاندارد به کار می رود. با میکروسکوپ الکترونی مشاهده شده است که این بندها حاصل از نواحی کروماتینی شدیدا فشرده و متراکم می باشند و همچنین می توانند حاصل تغییر هیستون ها و دیگر پروتئین های کروموزومی باشند. احتمال دیگر این است که DNA و پروتئین ها هر دو در ادامه واکنش های سیتو شیمیایی و در ادامه عمل با گیمسا بندها را نشان می دهند. بر اساس این تکنیک سه بخش ساختمانی مشخص در کروموزوم ها مشاهده می گردد:

1- هتروکروماتین ساختمانی سانترومری

2- هتروکروماتین جزیره ای

3- یوکروماتین

به همین دلیل شاید بتوان گفت که DNA به تنهایی مورد واکنش در رنگ آمیزی نیست . و اهمیت آن نسبت به سایر مواد تشکیل دهنده کمتر است . در این رابطه باید اضافه نمود که هرچه کروموزوم ها متراکم تر باشند امکان تشخیص بندها کمتر و در مواردی وجود ندارد. بر اساس تصوری در رنگ گرفتن و بند بند شدن کروموزوم ها دو عامل ساختمانی و عملکردی مهم می باشند یا به عبارت دیگر این امر به وجود ژن های فعال، غیر فعال و کم فعال بر می گردد. اختلاف در سنتز پروتئین اساس G- banding و رنگ گرفتن است. نقاط روشن نمایانگر فعالیت بیشتر ژن ها می باشد و ژن های کم فعال در فاز S همانند سازی با تاخیر انجام می دهند و این نواحی غنی از AT بوده و رنگ پذیری تیره تری را نشان می دهند. G- Band ها را می توان در سایر موجودات مثل حشرات، خزندگان، دوزیستان، پرندگان و پستانداران مشاهده نمود.

نقش پروتئین ها در نوار بندی G :

خروج بعضی از پروتئین ها، اثر اسید استیک ( محلول فیکساتیو ) و خارج کردن ترکیبات بخصوصی از کروموزوم احتمالا هیستون ها و non هیستون ها.

C-banding :

C- Banding یا سانترومر بندینگ و یا بندینگ هتروکروماتین ساختمانی روشی است که از آن برای رنگ آمیزی قسمت های خاص یا ساختارهای خاصی از کروموزوم استفاده می شود. رنگ پذیری در این متد مربوط به هتروکروماتین ساختمانی می باشد ( شکل 5 ). این متد و دیگر متدهای رنگ آمیزی با گیمسا در مقاله ( Pardue / Gall ) در سال 1970 مطرح گردیدند.

C- band ها و کروموزوم y :

این متد برای بررسی کروموزوم y پستانداران به دلیل اینکه اغلب بطور کامل و شدیدا هتروکروماتینی می باشد کاربرد دارد.

اندازه C- band ها:

اندازه C- band ها ممکن است از فردی به فرد دیگر تغییر کرده و متفاوت باشد که این ممکن است با مقادیر متفاوت DNA ساتلیت مطابقت داشته باشد.

C- banding در گیاهان:

این متد در گیاهان نیز بکار می رود و با این تکنیک روشن شده است که هتروکروماتین گیاهان ممکن است بیشتر از جانوران خود را نشان دهد.

روش های دست یابی به C- band ها:

با استفاده از اسید ، باز یا درجه حرارت بالا، DNA معمولی Denature ( تک رشته ای ) شده و سپس در طول شب ( over night ) در دمای c 60  در محلول سالین سیترات ( Saline- Citrate ) قرار داده می شود. بر اثر این عمل DNA دوباره Renature شده و به حالت اولیه بر می گردد. در این روش DNA شدیدا تکراری ( هتروکروماتین ساختمانی ) به حالت اولیه بازگشته در حالیکه DNA با تکرار کم و Unique DNA به همان حالت باقی می ماند که حاصل این عمل رنگ پذیری تفرقی می باشد. با این روش رنگ آمیزی کروموزوم ها را می توان با محلول های اشباع شده هیدروکسید باریم قبل از رنگ آمیزی با گیمسا Denature نمود.

در تلاش برای درک مکانیسم رنگ پذیری تفاوت اساسی از طریق immunolabelling کروموزوم های متافازی با آنتی بادی ها برای هیستون های استیله شده  و  مشاهده گردید . این آزمایش ها نشان می دهد که هر دو این بندها فاقد یا دارای مقادیر کمی هیستون استیله می باشند.

Q- Banding :

متد Q- Banding یا QFQ توسط Dr. Caspersson و همکارانش در ( 1968 ) 1970 مطرح گردید. این روش برای مطالعه کروموزوم های متافازی میتوزی به کار میرود. در این روش از رنگ های فلوئورسنت مانند proflavin / Quinacrine و Quinacrine Mustard و UV می استفاده می گردد. تشخیص کروموزوم های موش قبل از این روش به سختی صورت می گرفت . این روش در کنفرانس پاریس در 1971 متد Q-banding و بعدا QFQ نام گرفت ( 1SCN 1985 ).

R – banding :

این متد یا Reverse banding دارای الگوی بندینگ عکس G – band ها می باشد. ( نقاط روشن در این روش با مناطق تیره در G – banding مطابقت دارد ) . این روش اولین بار در 1971 توسط Dutrillaux و Lejeune مطرح گردید. این متد قابل برگشت به G – banding با افزایش PH می باشد. تعداد متدهای R – banding نسبت به متدهای G بندینگ چندان توسعه نیافته است. که شاید به این دلیل باشد که این متد به خوبی G بندینگ کامل نشده است.

مکانیسم R- banding :

مکانیسم R- banding بخوبی روشن نیست. بکارگیری گرما در این روش ایجاد Denaturation پروتئین های کروموزومی و ترادف های غنی از نوکلئوتیدهای AT می کند ولی DNA غنی از GC را در شکل طبیعی خود نگاه می دارد.

نوار بندی T :

نواربندی T یا T – banding روشی است که بخشی از R  بندها را مشخص می کند که در تلومرها قرار گرفته اند. T بندها با 1- گرمای شدید دادن به کروموزوم ها قبل از Staining با گیمسا 2- یا یک ترکیب از رنگ ها و فلوئوروکروم ها ( استراخان 1999 ) ایجاد می شوند. این نوار بندی با تغییر در فسفات مورد استفاده در نوار بندی R حاصل می شود. اگر PH بجای 5/6 به حدود 3/5 – 1/5 برسد اغلب نوارهای R ظاهر نشده و تنها آنهایی ظاهر می گردند که در انتهای کروموزوم واقع شده اند. T بندها به عنوان یک Subset از R بندها بوده و غنی از GC و ژن ( Gene rich and GC rich ) می باشند.

NOR بندینگ و N – banding :

در این روش نواحی خاص کروموزومی که شکل دهنده و نگه دارنده هستک ها در هسته های انتر فازی می باشند رنگ می گیرند. این متد همراه با C بندها متدی جالب برای گیاهان است. در این روش NOR ها به صورت نقطه یا نقاط تیره ای در راس کروموزوم های حامل از NOR ها به چشم می خورند احتمالا بیشتر NOR هایی رنگ پذیری را نشان می دهند که در مرحله اینترفاز قبلی فعال بوده باشند.

نواحی NOR دارای کپی های زیادی از ترادفهای DNA r یا ژن های مربوط به بخش بزرگتر (285 ) RNA ریبوزومی ( همچنین 18S ) می باشند.

NOR ها می توانند با استفاده از گیمسا ( N – banding ) یا نمک نقره بصورت – Ag NOR رنگ بگیرند.

مکانیسم:

کروموزوم ها با نوکلئازها و پروتئینازها قبل از رنگ آمیزی با نقره تیمار می شوند. یافته های Good pasture و همکاران وی ( 1976 ) نشان می دهد که NOR های فعال Impregnated شده توسط نقره در کروموزوم های متافازی نشان دهنده NOR های فعال در شکل گیری هستک و مرحله اینترفاز می باشند. این مشاهدات نشان می دهد که پروتئین های همراه با رونویسی سیسترون های ریبوزومی مسئول برای impregnated نقره می باشند.

در این متد رنگ نیترات نقره به پروتئین های نزدیک این نواحی که در خلال رونویسی فعال می باشند باند می شود. N – banding ها معین کننده همه نقاط NOR شامل نقاط فعال و غیر فعال می باشند. ( ولی رنگ آمیزی Ag فقط NOR های فعال را نشان می دهد )

الگوی Ag-NOR کروموزوم های آکروسانتریک در یک فرد دارای ویژگی های قابل توارث ثابت بوده و در مجموع با الگوهای R بندها در شناسایی منشا والدینی و همچنین برای Non- disjunction میتوزی در تریزومی های کروموزوم های آکروسانتریک انسانی کاربرد دارند.

با بکار گیری رنگ آمیزی Ag – NOR میلرو و همکاران ( 1978 ) قادر بودند تا نشان دهند که NOR ها در نوترکیبی کروموزومی اهمیت دارند. در لاین های سلولی موش ترانسلوکاسیون های رابرت سونین بین کروموزوم های دارای NOR نسبت به بقیه کروموزوم ها بیشتر می باشد احتمالا این پدیده در کروموزوم های انسانی به همان خوبی محتمل می باشد . این تکنیک ( Ag- NOR ) ابزار مفید و ارزشمندی برای آزمایش وضعیت NOR ها و ( delineating ) ( شناسایی و معین نمودن ) نقاط شکننده در هر دو ترانسلوکاسیون رابرت سونین و در ارزیابی فعالیت NOR در سلولهای سرطانی می باشد.

کاربردهای NOR بندینگ:

1- مطالعه کروموزوم های دارای دو ساتلیت

2- مطالعه پلی مورفیسم کروموزومی